阿卡波糖是治療2型糖尿病的一線藥物，但其療效常被腸道細(xì)菌中的“阿卡波糖殺手”——阿卡波糖糖苷水解酶（Apg）破壞。近日，中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所客座研究員/南京師范大學(xué)教授周佳海團(tuán)隊(duì)及其團(tuán)隊(duì)副研究員古陽(yáng)，聯(lián)合西北農(nóng)林科技大學(xué)教授張繼文團(tuán)隊(duì)等，在Nature Communications發(fā)表題為“Molecular insights of acarbose metabolization catalyzed by acarbose-preferred glucosidase”的最新研究成果，利用X射線晶體學(xué)、計(jì)算模擬和生化實(shí)驗(yàn)結(jié)合，深入解析了Apg水解阿卡波糖的精細(xì)分子機(jī)制（圖1），為設(shè)計(jì)新一代抗降解、更高效的降糖藥物提供了關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)藍(lán)圖。
一、阿卡波糖的困境：個(gè)體差異與耐藥性
阿卡波糖作為一種“偽四糖”，主要通過(guò)抑制腸道α-葡萄糖苷酶延緩碳水化合物吸收來(lái)降糖。它具有全身副作用少的優(yōu)點(diǎn)，但臨床應(yīng)用中存在顯著的個(gè)體療效差異和長(zhǎng)期用藥后的耐藥性問(wèn)題。近年中國(guó)科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心姜衛(wèi)紅團(tuán)隊(duì)與合作者研究發(fā)現(xiàn)（Nat. Metab.,2023,s42255-023-00796-w），克雷伯氏菌屬(K. grimontii TD1)中的Apg酶是導(dǎo)致阿卡波糖失效的關(guān)鍵“元兇”。它能高效降解阿卡波糖為acarviosine-glucose（M1）和acarviosine（M2），從而破壞其藥效（圖2）。然而，由于缺乏酶-底物/產(chǎn)物復(fù)合物的精確結(jié)構(gòu)信息，導(dǎo)致該酶動(dòng)態(tài)催化過(guò)程的分子機(jī)制仍不明晰，限制了糖尿病治療的優(yōu)化及抗糖尿病藥開(kāi)發(fā)。解析Apg獨(dú)特的催化機(jī)制將有助于抗糖尿病藥物的設(shè)計(jì)。
二、 鎖定“殺手”：Apg的結(jié)構(gòu)與特性
Apg屬于糖苷水解酶家族13_21 (GH13_21)，通常負(fù)責(zé)水解α-1,4-O-糖苷鍵。但其獨(dú)特之處在于能有效水解結(jié)構(gòu)復(fù)雜的阿卡波糖。研究解析了Apg的高分辨率晶體結(jié)構(gòu)（圖3）：（1）Apg在溶液中以同源二聚體形式存在，單體間通過(guò)N端結(jié)構(gòu)域和催化結(jié)構(gòu)域呈頭尾排列。（2）催化結(jié)構(gòu)域采用經(jīng)典的TIM桶折疊，活性位點(diǎn)是位于TIM桶頂部的一個(gè)突出表面凹槽，凹槽底部有一個(gè)絕對(duì)保守的催化三聯(lián)體（Asp-Glu-Asp）。（3）與其他淀粉酶（如MaIZ,MaIS）相比，Apg的活性口袋裂隙更窄（7.9 ?），能緊密結(jié)合阿卡波糖，計(jì)算也顯示其對(duì)阿卡波糖的結(jié)合親和力更高。（4）結(jié)合生化實(shí)驗(yàn)、晶體結(jié)構(gòu)和計(jì)算分析，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)關(guān)鍵的柔性環(huán)（loop A和loop B）不僅影響底物結(jié)合還決定其催化能力。
三、 重要發(fā)現(xiàn)：Apg催化機(jī)制的關(guān)鍵角色
通過(guò)分析Apg與阿卡波糖及其水解產(chǎn)物（M1,M2）的復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)，結(jié)合定點(diǎn)突變和計(jì)算模擬（QM/MM,MD）（圖4），研究揭示了催化機(jī)制的核心要素，并推翻了之前的假設(shè)：
- 真正的“攻擊手”——親核試劑：以往認(rèn)為D336是親核試劑，但本研究確鑿證明D448才是關(guān)鍵的親核試劑。首先，定點(diǎn)突變顯示D448N變體完全喪失催化活性。其次，D448N突變體能緊密結(jié)合阿卡波糖，其復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示D448N的羧基氧（OD2）距離阿卡波糖被攻擊的C1原子（4.2 ?）比D336的羧基氧（5.0 ?）更近。同時(shí)，密度泛函理論（DFT）計(jì)算顯示D448 OD2攜帶更強(qiáng)的負(fù)電荷（-0.49 vs D336的-0.12），親核性更強(qiáng)。進(jìn)一步的 QM/MM計(jì)算證明D448作為親核試劑的能壘（17.1 kcal/mol）遠(yuǎn)低于D336（26.7 kcal/mol）。最后，D448E突變能部分恢復(fù)活性（15%），支持其羧酸側(cè)鏈直接參與催化。
- 雙“供水者”——質(zhì)子供體：除了之前已知的E373作為質(zhì)子供體外，還揭示R334也是重要的質(zhì)子供體。定點(diǎn)突變顯示，E373A和E373Q突變保留部分活性，暗示存在其他質(zhì)子供體。雙重突變E373A/R334A導(dǎo)致活性完全喪失，證明R334是關(guān)鍵的替代質(zhì)子供體。進(jìn)一步的QM/MM結(jié)果支持R334作為質(zhì)子供體，其反應(yīng)能壘略高于E373。
- “穩(wěn)定器”——D336：D336A突變保留了約48%的活性，其復(fù)合物結(jié)構(gòu)顯示它主要通過(guò)與底物形成氫鍵來(lái)穩(wěn)定過(guò)渡態(tài)或底物構(gòu)象，而非直接作為親核試劑。
四、 水解路徑揭秘：兩步反應(yīng)，一步限速
阿卡波糖被Apg水解的最終產(chǎn)物是二環(huán)的M2。關(guān)于M2是如何產(chǎn)生的，存在疑問(wèn)：（1）是阿卡波糖直接一步水解成M2和麥芽糖？計(jì)算模擬（QM/MM）顯示此路徑能壘極高（36.9 kcal/mol），且實(shí)驗(yàn)中未檢測(cè)到麥芽糖副產(chǎn)物，排除了此可能性。（2）還是分步水解？晶體實(shí)驗(yàn)觀察到將Apg與中間產(chǎn)物M1孵育可生成M2。結(jié)合動(dòng)力學(xué)和熱力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，Apg對(duì)阿卡波糖的親和力遠(yuǎn)高于對(duì)M1。進(jìn)一步的自由能計(jì)算發(fā)現(xiàn)，Apg-阿卡波糖復(fù)合物的結(jié)合自由能（-20.5 kcal/mol）顯著低于Apg-M1（-13.8 kcal/mol）。QM/MM計(jì)算顯示，從M1水解到M2的能壘（19.7 kcal/mol）高于從阿卡波糖水解到M1的能壘（17.1 kcal/mol）。因此，阿卡波糖被Apg水解是一個(gè)明確的兩步過(guò)程：第一步為阿卡波糖→M1+葡萄糖（相對(duì)較快），第二步為M1→M2+葡萄糖（此步是限速步驟，較慢）。
五、耐藥類似物的啟示：結(jié)構(gòu)差異決定命運(yùn)
研究還利用解析的Apg結(jié)構(gòu)，對(duì)已知對(duì)Apg具有抗性的阿卡波糖類似物——acarstatins A和acarstatins B進(jìn)行了計(jì)算分析。分子動(dòng)力學(xué)模擬顯示，它們也能結(jié)合在Apg活性腔內(nèi)。但關(guān)鍵差異在于，它們分子中水解位點(diǎn)C1原子與親核試劑D448 OD2的距離比阿卡波糖中的距離更遠(yuǎn)，使得D448難以有效攻擊其糖苷鍵。進(jìn)一步的QM/MM計(jì)算證實(shí)，水解acarstatinsA/B的活化能壘高于阿卡波糖。這為設(shè)計(jì)抗Apg降解的新藥提供了直接線索：通過(guò)修飾改變底物關(guān)鍵原子與催化殘基（特別是D448）的空間距離或相互作用。
綜上，本文通過(guò)晶體結(jié)構(gòu)解析、生化實(shí)驗(yàn)以及理論計(jì)算對(duì)Apg催化阿卡波糖水解反應(yīng)機(jī)理進(jìn)行了深入研究。揭示了Apg水解阿卡波糖的真實(shí)分子機(jī)制（D448為親核試劑，E373/R334為質(zhì)子供體，D336為穩(wěn)定劑，兩步水解且第二步限速），為糖尿病藥物的設(shè)計(jì)與開(kāi)發(fā)提供結(jié)構(gòu)方面的見(jiàn)解，包括延長(zhǎng)糖鏈的長(zhǎng)度以增強(qiáng)其對(duì)抗Apg水解的能力，或者對(duì)阿卡波糖的結(jié)構(gòu)部分進(jìn)行選擇性修飾以降低其結(jié)合親和力。基于以上結(jié)構(gòu)見(jiàn)解，對(duì)下一代阿卡波糖類似物的研究正在進(jìn)行中。
本文的通訊作者為中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院合成生物學(xué)研究所客座研究員/南京師范大學(xué)教授周佳海、團(tuán)隊(duì)副研究員古陽(yáng)，以及西北農(nóng)林科技大學(xué)教授張繼文。第一作者為中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院與西北農(nóng)林科技大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)已畢業(yè)博士研究生黃嘉詠。中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院助理研究員諶莊琳博士對(duì)于理論計(jì)算部分做出了重要貢獻(xiàn)。感謝中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院助理研究員王蘭騰博士在晶體解析方面的付出。感謝中國(guó)科學(xué)院深圳先進(jìn)技術(shù)研究院與中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)聯(lián)合培養(yǎng)已畢業(yè)碩士研究生肖小云的付出。該工作受到廣東省科技計(jì)劃項(xiàng)目、國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目、深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目以及深圳合成生物學(xué)創(chuàng)新研究院等項(xiàng)目的資助。衷心感謝上海光源和國(guó)家蛋白質(zhì)科學(xué)研究（上海）設(shè)施生物大分子晶體學(xué)線站BL18U1、BL19U1工作人員在數(shù)據(jù)收集方面的大力協(xié)助！
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原文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-025-62855-y
圖1.?Apg催化水解阿卡波糖的機(jī)制
圖2.?由Apg介導(dǎo)的阿卡波糖降解途徑
圖3. Apg的總體結(jié)構(gòu)示意圖
圖4 Apg?的復(fù)合物結(jié)構(gòu)及突變酶活分析。（A）Apg?活性位點(diǎn)腔內(nèi)底物阿卡波糖的示意圖。（B）Apg(D448A)-阿卡波糖的復(fù)合物結(jié)構(gòu)（PDB ID：9IVZ）。（C）Apg(D336A)-M1的復(fù)合物結(jié)構(gòu)（PDB ID：9IZE）。（D）Apg(D336A)-M2的復(fù)合物結(jié)構(gòu)（PDB ID：9IZO）。（E）Apg(D448A)-阿卡波糖復(fù)合物（PDB ID：9IVZ）（殘基為粉色）與突變體?Apg(D448A)（PDB?編號(hào)：9IXH）的結(jié)構(gòu)疊加（殘基為白色）。（F）Apg?活性位點(diǎn)上殘基的誘變實(shí)驗(yàn)。
圖5. Apg催化阿卡波糖水解反應(yīng)的兩步過(guò)程
圖6. Apg-acarstatins?A/B復(fù)合物的距離特征分析
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